Določanje vsebnosti oksalne kisline v sadju in zelenjavi z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC)

Določitev Oksalna kislina Vsebnost v sadju in zelenjavi z visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC)
1. Eksperimentalno načelo in zasnova metode
Kot pogosta organska kislina v sadju in zelenjavi vsebnost oksalne kisline neposredno vpliva na okus in hranilno vrednost hrane. Ta poskus uporablja reverzno-fazno visokozmogljivo tekočinsko kromatografijo (RP-HPLC). V kislih pogojih mobilne faze se oksalna kislina loči od motečih snovi z uporabo kromatografske kolone C18. Za kvantitativno analizo, ki temelji na UV absorpcijskih značilnostih karboksilnih skupin v molekulah oksalne kisline, se uporablja ultravijolični detektor, nastavljen na 210 nm.
2. Standardna krivulja in priprava vzorca
Za pripravo standardnih raztopin se uporablja metoda gradientnega redčenja: natančno se stehta 25,0 mg oksalne kisline dihidrata in razredči na 25 ml z ultračisto vodo, da se dobi osnovna raztopina s koncentracijo 1 mg/ml. To se nato zaporedno razredči v serijo standardnih raztopin s koncentracijo 50, 100, 200, 400 in 800 µg/ml, pri čemer se vsaka koncentracija injicira v treh ponovitvah.
Za pripravo vzorca se uporablja ekstrakcija s pomočjo mikrovalov: stehtamo 5,00 g homogenata sadja/zelenjave, dodamo 10 ml 0,1 mol/L raztopine klorovodikove kisline, obdelamo pri 60 °C z mikrovalovi 10 minut, filtriramo skozi 0,45 µm membranski filter in zberemo filtrat za testiranje.
3. Optimizacija kromatografskih pogojev
Mobilna faza je sistem 0,01 mol/L kalijevega dihidrogenfosfatnega pufra (pH 2,5)–acetonitrila (95:5), s pretokom 0,8 ml/min in temperaturo kolone 35 °C. Prilagajanje deleža acetonitrila kaže, da se retencijski čas oksalne kisline skrajša na manj kot 3 minute, ko organska faza preseže 10 %, vendar pride do pojavljanja vrhov. V končnih optimiziranih pogojih je retencijski čas oksalne kisline 4,2 minute, s čimer se doseže popolna ločitev od sosednje citronske in jabolčne kisline (ločljivost > 1,5).
4. Validacija metode
Preverjanje linearnega območja kaže dobro linearno razmerje med površino vrha in koncentracijo v območju 10–1000 µg/mL (R² = 0,9993). Meja detekcije (LOD), določena z metodo razmerja signal/šum, je 0,5 µg/mL. V testih ponovljivosti je RSD za šest ponovljenih določitev istega vzorca špinače 1,8 %. Poskusi izkoristka s konicami na treh ravneh (80 %, 100 % in 120 %) dajo povprečne izkoristke 98,2 %, 102,4 % oziroma 97,8 %, kar izpolnjuje zahteve za kvantitativno analizo.
5. Analiza realnih vzorcev
Testiranih je bilo šest komercialno dostopnih vrst sadja in zelenjave: špinača (356 ± 12 mg/100 g), zelena (215 ± 9 mg/100 g), paradižnik (18 ± 2 mg/100 g), jabolko (6 ± 1 mg/100 g), banana (ni bila zaznana) in brokoli (89 ± 5 mg/100 g). Primerjava z nacionalno standardno metodo (GB 5009.277-2016) kaže, da je relativno odstopanje med metodama manjše od 5 %, kar potrjuje zanesljivost te metode. Metoda HPLC kaže še posebej večjo občutljivost kot tradicionalne titracijske metode pri analizi vzorcev z nizko vsebnostjo.
6. Ključne opombe
Med predobdelavo vzorca strogo nadzorujte vrednost pH. Če pH ekstrakta preseže 3, bo obarjanje kalcijevega oksalata povzročilo nizke rezultate testov. Mobilno fazo je treba vsak dan pripraviti svežo, da se prepreči obarjanje soli in blokada kolone. Po vsakih 20 injekcijah kolono 30 minut spirajte z mešanico acetonitrila in vode (30:70), da preprečite zmanjšanje učinkovitosti kolone. Pri vzorcih, ki vsebujejo pigmente (npr. vijolično zelje), je priporočljivo, da pred injekcijo dodate korak čiščenja s trdnofazno ekstrakcijo.
7. Navodila za uporabo in širjenje
To metodo je mogoče razširiti na zaznavanje oksalne kisline v bioloških vzorcih, kot sta urin in kri. Z prilagoditvijo sestave mobilne faze (npr. z dodajanjem tetrabutilamonijevega hidroksida) je mogoče oksalno kislino in njene metabolite določiti hkrati. V kombinaciji z detektorjem masne spektrometrije je mogoče vzpostaviti natančnejšo metodo zaznavanja sledi. V živilskopredelovalni industriji lahko ta metoda zagotovi pomembno podatkovno podporo za izbiro sort z nizko vsebnostjo oksalne kisline in optimizacijo procesov kuhanja.